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实验案例
NTC挑战- “你的Cq值注水了吗？”
来源: | 作者:toroivd | 发布时间: 2023-05-05 | 303 次浏览 | 分享到:
NTC挑战起因

 很多试剂厂家仅以“Cq值低”来宣称试剂性能，但绝大多数是因为qPCR试剂的特异性低，从而使得引物二聚体的非特异性扩增造成“Cq值低”和“灵敏度”高的假象, 从而使科研工作者从方法学根本上失去了科研的严谨性。


NTC挑战依据


2009年国际上多名科学家联合制定了MIQE指南，即发表定量PCR实验数据至少提供的信息，作为RT-qPCR文章发表的国际化标准。SYBR Green qPCR试剂是∆∆Cq相对定量法进行基因表达分析的关键试剂,MIQE中指出“对于SYBRGreen I法,无模板阴性对照的Cq值”及“特异性验证(熔解曲线)”作为必要性指标要在发表论文中提供。


图片


[1] Bustin S A,Vladimir B, Garson J A, et al. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments[J]. Clinical Chemistry, 2009(4):611.



NTC挑战引物


Stevens AJ等[2]发现“许多商品化PCR试剂容易在PCR过程形成二聚体”的问题,并建立必然形成二聚体的引物的NTC(无模板阴性对照)扩增来验证试剂特异性的方法。

NTC Validation Primer Mix II 序列来源于Stevens AJ等,序列如下:

Primer Set 2F (telg): ACACTAAGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTAGTGT

Primer Set 2R (telc): TGTTAGGTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTAACA


[2]Stevens A J , Appleby S , Kennedy M A . [Letter to the Editor] Many commercial hot-start polymerases demonstrate activity prior to thermal activation[J]. BioTechniques, 2016, 61(6).



NTC挑战包成分


组分

体积

TOROGreen® qPCR Master Mix

(QST-100)

1mL

TOROGreen® HRM qPCR Master Mix

(QET-100)

1mL

NTC Validation Primer Mix II (各 8μM)

100μL

DNase/RNase Free Water

1mL




NTC挑战结果


我们使用NTC挑战包在中国几百家实验室挑战了国内外常用11种品牌的qPCR试剂，发现本公司试剂QET-100的特异性最高，QST-100特异性仅次于国际一流品牌水平。统计数据如下，NTC扩增，Cq值越高，特异性越好！