[摘要]：目前科研人员严重缺乏对MIQE指南的理解，从而在选择qPCR试剂上进行盲目品牌崇拜或追求低价，使得qPCR实验数据不可信。MIQE清单中明确指出“无模板对照（NTC）均需无任何PCR扩增”，这是为了排除引物二聚体扩增“伪影”。我们随机从Nature Communications期刊中抽取两篇涉及qPCR数据的文章，对所有引物及试剂组成的qPCR体系进行NTC验证。结果发现67对引物的201次实验中，使用文献中V品牌的反应体系49.8%的扩增“伪影”，qPCR体系合格率仅为31.3%，从而极大降低了这两篇文献qPCR数据的可信性。进一步使用同样引物的情况下，使用TOROIVD的QST-100，QET-100及QST-200进行扩增时，扩增“伪影”仅仅分别为：5.4%，2.0%及7.4%。其中cmyb引物在所有试剂中均有扩增“伪影”，需重新设计引物来避免引物二聚体的发生。结果说明qPCR数据不可信是一种普遍现象，而选用高特异性的试剂是提高数据可信度的主要解决方法，可大大降低引物设计的要求。

1.材料和方法 

为了验证已经发表文章qPCR数据的可信性，随机抽取了国际知名期刊-Nature Communications的两篇涉及qPCR数据的文章，对文中所有引物进行NTC实验验证。  

合成以上论文中所有引物，使用 Bio-Rad CFX96 仪器进行NTC实验；验证qPCR试剂为： 

1.V品牌试剂 (两篇论文使用)

2.TOROGreen® qPCR Master Mix (TOROIVD，QST-100) 

3.TOROGreen® HRM qPCR Master Mix (TOROIVD，QET-100)

4.TOROGreen® 5G qPCR Premix 2.0 (TOROIVD，QST-200)   

反应条件按照各自产品说明书条件，引物浓度使用0.4µM/反应，每个实验3个重复。 

2. 结果与讨论 

NTC实验结果如表1所示，扩增图及熔解曲线图联系我们。发现使用已发表文章中上V品牌试剂和引物进行NTC实验时，201个反应中有100个反应出现扩增“伪影”，假阳性率占比达49.8%，NTC无扩增的合格反应体系仅为31.3%。扩增“伪影”造成这两篇文章的Cq值出现假降低风险，不符合MIQE要求，从而qPCR数据严重不可信。 

针对这种情况V品牌试剂厂家往往解释需要调整引物设计和浓度来解决，但是这种情况比例过大，会大量浪费时间和金钱成本，在现实情况下根本无法实现。 

进一步，我们使用TOROIVD的三种试剂来做NTC实验，结果如表2所示。 使用QST-100时，201个反应中仅11个反应出现扩增“伪影”，假阳性率占比5.4%，NTC无扩增的合格反应体系89.6%。使用QET-100时，201个反应中仅4个反应出现扩增“伪影”，假阳性率占比2%，NTC无扩增的合格反应体系97%。使用QST-200时，201个反应中仅15个反应出现扩增“伪影”，假阳性率占比7.4%，NTC无扩增的合格反应体系85.1%。 

在同样的引物下，染料法qPCR试剂特异性顺序为QET-100>QST-100>QST-200>V品牌。其中cmyb基因的引物在所有体系中均有扩增“伪影”，需要引物重新设计。这四种试剂中假阳性率决定了重新引物设计的工作量。V品牌因特异性太差，让重新设计引物工作量很大，基本无法实现。而TOROIVD的三款试剂因其高特异性可大大降低引物重新设计的工作量。 

表1.  67对引物及四种qPCR试剂的NTC实验结果

3. 结论 

虽然2009年国际科学家已经制定了MIQE指南，但在2017年发现很多科学家“说一套，做一套”，qPCR数据依然不可信。为此2019年8月国际标准化组织基于MIQE制定了ISO20395:2019标准，2022年12月30日中国依据ISO20395:2019发布了GB/T42077—2022国家标准文件，为中国的研究机构及研发企业等提供了qPCR规范化的标准。虽然制定了系列qPCR标准文件的，但在科研及工业领域执行几乎很少。极少qPCR生产试剂厂家能理解此规范，仅仅宣称“Cq值低”及“荧光信号高”来误导科研客户，并且已经严重“洗脑”，使得大量文章qPCR数据不可信。 按照这些标准文件，基于Cq值的定量计算，首先要确保Cq值的真实性，所以排除引物二聚体扩增“伪影”（artefacts）造成的“伪Cq值”偏差是要放到首要位置。这种“伪影”偏差的产生源于“引物设计”及“qPCR试剂特异性”双重因素影响。使用NTC实验可以简单快速地判断这两个因素，重新设计引物或更换高特异试剂。TOROIVD基于MIQE对染料法qPCR体系设计了三款高特异染料法qPCR试剂QST-100，QET-100及QST-200，降低了对引物设计要求。最大程度避免了扩增“伪影”的产生，保证了Cq值的真实性。 

4. 参考文献 

[1] Bustin S A , Benes V , Garson J A ,et al.The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments[J]. American Association for Clinical Chemistry, 2009(4). [2] GB/T42077—2022, 生物技术 核酸靶序列定量方法的性能评价要求 qPCR法和dPCR法.中国：国 家 标 准 化 管 理 委 员 会，2022.12.30. [3] Bustin S, Nolan T .  Talking the talk, but not walking the walk: RT‐qPCR as a paradigm for the lack of reproducibility in molecular research[J].  European Journal of Clinical Investigation, 2017, 47(10). [4] Ruiz-Villalba, Adrián, Van Pelt-Verkuil E , Gunst Q D ,et al.Amplification of nonspecific products in quantitative polymerase chain reactions (qPCR)  [J].  Biomolecular Detection & Quantification, 2017, 14(14):7-18. [5] Adrián Ruiz-Villalba, Ruijter J M , Hoff M J B V D .Use and Misuse of Cq in qPCR Data Analysis and Reporting[J].Life, 2021, 11(6):496. [6] Stevens A J , Appleby S , Kennedy M A .[Letter to the Editor] Many commercial hot-start polymerases demonstrate activity prior to thermal activation[J].BioTechniques, 2016, 61(6).