1. 问：QET-100 熔解曲线的 Tm 值相比竞品更低，对扩增是否有影响？

    答：对扩增无影响，试剂特殊配比使得 QET-100 的 Tm 值较低，反而有利于扩增高 GC 含量的模板。

2. 问：QET-100 的 CT 值相比竞品较高，是否意味着扩增效率低？

    答：扩增效率的高低需要通过标准曲线来判断，CT 值的高低并不能反映扩增效率。QET-100 的特异性好，不易出现引物二聚体，数据真实，在验证 NTC（无模板阴性对照）无扩增的情况下对比 CT 值的高低具有实际意义。最后需要检查 QET-100 反应体系配制时是否室温融化和加样。

3. 问：使用 QET-100 时可以更改加样体系吗？

    答：该试剂为 2×预混液，使用量为反应总体系的一半，引物和模板的加样量可进行调节，最后加水补足即可。

4. 问：QET-100 在 -20℃ 长时间放置会后产生沉淀，这对定量有影响吗？

    答：QET-100 中含有较高浓度的稳定剂，该产品稳定性好，但长期低温保存时稳定剂可能会有部分析出产生沉淀，使用时请充分涡旋振荡，待沉淀完全溶解后再进行体系配制（难以融化时可置于 25℃ 水浴锅进行融化），对试剂性能无影响。

5. 问：反应结束时无扩增曲线应该如何处理？

    答：（1）反应循环数不够：一般设置循环数为 40，但需要注意的是过多的循环会增加过多的背景信号，降低数据可信度。

           （2）确认程序中是否设置了信号采集步骤：两步法扩增程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段；三步法扩增程序应当将信号采集设置在 72℃ 延伸阶段。

           （3）引物不合适：重新设计引物；确认引物是否降解：长时间未用的引物应先通过 PAGE 电泳检测完整性，以排除其降解的可能。

           （4）模板浓度太低：减少稀释度重复实验，一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。

           （5）模板降解：重新制备模板，重复实验。

6. 问：重复性差应该如何处理？

    答：（1）将模板做 5-10 倍稀释，以大体积加入反应体系中。

           （2）定量 PCR 仪不同位置温度控制不一致。定期校准仪器。

           （3）模板浓度太低。模板浓度越低，重复性越差，提高模板的加样体积。

           （4）做 4-6 个复孔，删除其中重复性不好的孔，剩余的进行后续计算。