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    商品描述

    高稳定高特异染料法定量 PCR Mix



     高稳定高特异染料法定量 PCR Mix


     TOROGreen® HRM qPCR Mix

                         本品具有极高稳定性,需在室温融化和加样,不宜进行粗样本扩增实验。                          

            高稳定性:缓冲液中添加了独特的稳定剂,37℃ 放置一周性能保持不变,方便试剂的运输和保存。

            高特异性:具有极高的特异性,能有效避免引物二聚体和非特异性扩增的产生,使实验结果更可靠。

            兼容高GC含量模板缓冲液中添加了独特的增强剂,具有更低的解链温度,可兼容 GC 含量高达 80% 的模板,从而简化引物设计。

            宽泛的线性范围,兼容多个平台:至少 8 个浓度梯度下具有极高地扩增效率,为模板浓度提供广泛的线性区间。

            高分辨率熔解曲线:采用饱和荧光染料 Super EvaGreen,可以进行高分辨率熔解曲线分析。


     1. 高分辨率熔解曲线

            以 Aope 基因为模板对小鼠进行分型,使用 QET-100 扩增 Aope 模型小鼠基因组 DNA,并通过熔解曲线的结果来对小鼠进行基因分型,熔解曲线如图 1-a 和 1-b 所示:



    1 高分辨率熔解曲线

    Fig.1 High Resolution Melt Curve


            结果:从熔解曲线中可以看到,通过 DNA 模板结合 Super EvaGreen染料的差异,荧光值划分为明显的三种峰,分别代表了野生型、杂合型和纯合型三种小鼠。

            结论:通过添加的饱和荧光染料 Super EvaGreen,QET-100可以进行高分辨率熔解曲线分析,替代了部分探针法荧光定量的使用,例如 SNP 位点识别,基因分型等,极大降低了实验成本。


            TOROGreen® HRM qPCR Master Mix 是 TOROIVD 公司开发的基于 Eva Green 染料的定量 PCR 试剂盒,包含除引物和模板外的所有组分。该产品采用抗体法修饰的热启动 Taq 酶,不仅可进行高稳定、高特异的通用定量 PCR 分析,还可以进行高分辨率熔解曲线分析、SNP 检测和基因分型等。该酶经过特殊配方优化,建议室温操作加样,试剂中已预混参比 ROX,无需单独添加,兼容绝大部分定量 PCR 仪。



    组分货号

    组分名称

    包装规格

    数量

    保存温度

    QET-100

    TOROGreen® HRM qPCR Master Mix

    1 mL/管

    10 管

    2-8℃ 保存半年

    -20℃ 保存两年


            2-8℃ 保存半年,-20℃ 保存两年。


    1. 问:QET-100 熔解曲线的 Tm 值相比竞品更低,对扩增是否有影响?


        答:对扩增无影响,试剂特殊配比使得 QET-100 的 Tm 值较低,反而有利于扩增高 GC 含量的模板。


    2. 问:QET-100 的 CT 值相比竞品较高,是否意味着扩增效率低?


        答:扩增效率的高低需要通过标准曲线来判断,CT 值的高低并不能反映扩增效率。QET-100 的特异性好,不易出现引物二聚体,数据真实,在验证 NTC(无模板阴性对照)无扩增的情况下对比 CT 值的高低具有实际意义。最后需要检查 QET-100 反应体系配制时是否室温融化和加样。


    3. 问:使用 QET-100 时可以更改加样体系吗?


        答:该试剂为 2×预混液,使用量为反应总体系的一半,引物和模板的加样量可进行调节,最后加水补足即可。


    4. 问:QET-100 在 -20℃ 长时间放置会后产生沉淀,这对定量有影响吗?


        答:QET-100 中含有较高浓度的稳定剂,该产品稳定性好,但长期低温保存时稳定剂可能会有部分析出产生沉淀,使用时请充分涡旋振荡,待沉淀完全溶解后再进行体系配制(难以融化时可置于 25℃ 水浴锅进行融化),对试剂性能无影响。


    5. 问:反应结束时无扩增曲线应该如何处理?


        答:(1)反应循环数不够:一般设置循环数为 40,但需要注意的是过多的循环会增加过多的背景信号,降低数据可信度。

               (2)确认程序中是否设置了信号采集步骤:两步法扩增程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段;三步法扩增程序应当将信号采集设置在 72℃ 延伸阶段。

               (3)引物不合适:重新设计引物;确认引物是否降解:长时间未用的引物应先通过 PAGE 电泳检测完整性,以排除其降解的可能。

               (4)模板浓度太低:减少稀释度重复实验,一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。

               (5)模板降解:重新制备模板,重复实验。


    6. 问:重复性差应该如何处理?


        答:(1)将模板做 5-10 倍稀释,以大体积加入反应体系中。

               (2)定量 PCR 仪不同位置温度控制不一致。定期校准仪器。

               (3)模板浓度太低。模板浓度越低,重复性越差,提高模板的加样体积。

               (4)做 4-6 个复孔,删除其中重复性不好的孔,剩余的进行后续计算。


    TOROGreen® HRM qPCR Mix.pdf


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