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    高稳定高GC染料法定量PCR Mix



     高稳定高GC染料法定量PCR Mix


     TOROGreen®qPCR Master Mix

      高稳定性:缓冲液中添加了独特的稳定剂,37℃ 放置一周性能保持不变,方便试剂的运输和保存。

      高特异性:具有极高的特异性,能有效避免引物二聚体和非特异性扩增的产生,使实验结果更可靠。

      兼容高GC含量模板:缓冲液中添加了独特的增强剂,具有更低的解链温度,可兼容 GC 含量高达 80% 的模板,从而简化引物设计。

      宽泛的线性范围,兼容多个平台:至少8个浓度梯度下具有极高地扩增效率,为模板浓度提供广泛的线性区间。 

     

     1.  高稳定性验证

      将 pET28a  质粒进行 8 个 10 倍梯度稀释作为模板,使用 37℃ 下保存一周的 QST-100 和 -20℃ 下保存的 QST-100 同时对稀释好的模板进行定量实验,每孔加样量 5 µL,扩增曲线和标准曲线如图 1-a 和 1-b 所示:


                  

    图1 高稳定性验证

    Fig.1 Validation of high stability  


      结果:从扩增曲线中可以看到 37℃ 下保存一周的 QST-100 和 -20℃ 下保存的 QST-100 扩增曲线一致,CT 值基本接近,从标准曲线中可以看到不同温度下保存的试剂扩增效率均在 95%-100%之间,R2值均为 0.999。

      结论:QST-100 具有极高的稳定性,同时具有卓越的扩增效率,在宽广的模板量区间内具有优秀的线性关系。



     2.  QST-100 与国产 N 品牌特异性对比

      将 pET28a  质粒进行 8 个 10 倍梯度稀释作为模板,使用 QST-100 和国产 N 品牌按照各自说明书推荐的体系(模板加样量相同),使用同一程序同时对稀释好的模板进行定量实验,熔解曲线如下图所示:


    2 QST-100 与国产 N 品牌特异性对比

    Fig.2 Comparison of specificity  between QST-100 and Brand N


      结果:从熔解曲线中可以看到,QST-100在低浓度和高浓度模板下均为单一峰值,而在低浓度模板下,国产 N 品牌出现了非特异性扩增。

      结论:QST-100 熔解曲线峰值单一,具有高特异性,符合 MIQE 要求。



     3.  QST-100 与进口 T 品牌扩增效率对比

      将 pET28a  质粒进行 5 个 10 倍梯度稀释作为模板,使用 QST-100 和进口 T 品牌按照各自说明书推荐的体系(模板加样量相同),使用同一程序同时对稀释好的模板进行定量实验,扩增曲线和熔解曲线如图 3-a 和 3-b 所示:


    3 QST-100 与进口 T 品牌扩增效率对比

    Fig.3 Comparison of amplification efficiency between QST-100 and Brand T


      结果:从扩增曲线中可以看到在同一模板浓度下,QST-100 比进口 T 品牌起峰早,CT 值小。从熔解曲线中可以看到两种试剂均没有出现非特异性扩增, 但QST-100 的 Tm 值低于进口 T 品牌。

      结论:在没有非特异性扩增产生的情况下,QST-100 扩增效率高,且有利于高 GC 含量模板扩增。


      TOROGreen® qPCR Master Mix 是 TOROIVD 一款经典定量 PCR 试剂盒,基于 SYBR Green I 染料法的 2×预混液,包含除引物和模板外的所有组分。本产品采用抗体法热启动的 Taq 酶,可进行高特异、高稳定的定量 PCR 分析。该酶通过特殊配方优化,适用于高 GC 含量模板的扩增,可在 37℃ 下 7 天性能保持不变,具有很高的稳定性,推荐室温加样操作。该试剂中已预混 ROX,可兼容大部分定量 PCR 仪。 已在中国科学院、复旦大学、浙江大学等高校研究所大量使用,具有良好的市场口碑。


      名称:TOROGreen®qPCR Master Mix

      货号:QST-100

      规格:20µL/200次


    组分货号

    组分名称

    包装规格

    数量

    保存温度


    QST-100



    TOROGreen® qPCR Master Mix


    1mL/管

    10管

      -20℃

    保存两年


     

      2-8℃保存半年,-20℃保存两年。


    1. 问:QST-100 熔解曲线的 Tm 值相比竞品更低,对扩增是否有影响?


        答:对扩增无影响,试剂特殊配比使得 QST-100 的 Tm 值较低,反而有利于扩增高 GC 含量的模板。


    2. 问:QST-100 的 CT 值相比竞品较高,是否意味着扩增效率低?


        答:扩增效率的高低需要通过标准曲线来判断,CT 值的高低并不能反映扩增效率。QST-100 的特异性好,不易出现引物二聚体,数据真实,在验证 NTC(无模板阴性对照)无扩增的情况下对比 CT 值的高低具有实际意义。最后需要检查 QST-100 反应体系配制时是否室温融化和加样。


    3. 问:使用 QST-100 时可以更改加样体系吗?


        答:该试剂为 2×预混液,使用量为反应总体系的一半,引物和模板的加样量可进行调节,最后加水补足即可。


    4. 问:反应结束时无扩增曲线应该如何处理?


        答: (1)反应循环数不够:一般设置循环数为 40,但需要注意的是过多的循环会增加过多的背景信号,降低数据可信度。

                (2)确认程序中是否设置了信号采集步骤:两步法扩增程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段;三步法扩增程序应当将信号采集设置在 72℃ 延伸阶段。

                (3)引物不合适:重新设计引物;确认引物是否降解:长时间未用的引物应先通过 PAGE 电泳检测完整性,以排除其降解的可能。

                (4)模板浓度太低:减少稀释度重复实验,一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。

                (5)模板降解:重新制备模板,重复实验。


    5. 问:重复性差应该如何处理?


        答:(1)将模板做 5-10 倍稀释,以大体积加入反应体系中。

               (2)定量 PCR 仪不同位置温度控制不一致。定期校准仪器。

               (3)模板浓度太低。模板浓度越低,重复性越差,提高模板的加样体积。

               (4)做 4-6 个复孔,删除其中重复性不好的孔,剩余的进行后续计算。


    TOROGreen®qPCR Master Mix.pdf


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